Статистика
Онлайн всього: 4 Гостей: 4 Користувачів: 0
|
 |
Матеріали для курсової |
ПЦР-СКРИНИНГ ACTINOBACILUS ACTINOMYCETEMCOMITANS, PORPHYROMONAS GINGIVALIS
|
| 08.11.2014, 11:36 |
| Основным этиологическим фактором воспалительных заболеваний пародонта считаются патогенные микроорганизмы зубного налета. Разные авторы (Дмитриева Л.А. 2001 г., Ivo Drizhal 2000 г) насчитывают от 300 до 400 видов микробов в полости рта человека. По данным литературы наиболее значимыми пародонтопатогенами являются Actinobacillus actinomycetemcomitans и Porphyromonas gingivalis (Дмитриева Л.А. 2001, Сивовол С.И. 2001, Безрукова И.В., Грудянов А.И. 2004). Оценивая роль того или иного микроорганизма в этиологии воспалительных заболеваний пародонта, учитывается комплекс его характеристик. Вирулентность патогенных микроорганизмов зависит от способности к адгезии, инвазивности, капсуло- и токсинообразования, наличия различных факторов преодоления механизмов защиты макроорганизма. Как известно иммунная протекция человека с возрастом меняется. Инволютивные изменения тканей пародонта имеют большое значение не только потому, что знание их помогает в диагностике заболеваний пародонта, но и в связи с тем, что старение тканей является сложной и до конца не изученной общемедицинской проблемой. Оно обусловлено изменениями в генетическом аппарате околозубных тканей, снижением обмена веществ, физико-химическими процессами на молекулярном уровне. Большую роль в старении тканей играют изменения сосудов, коллагена, активности ферментов, иммунобиологической реактивности, когда процессы распада клеток начинают преобладать над процессами их восстановления. Возрастные изменения сопровождаются снижением резистентности клеточных и тканевых элементов к действию местных факторов (травма, инфекция). Но на данный момент остается не изученной частота встречаемости Actinobacillus actinomycetemcomitans и Porphyromonas gingivalis у разных возрастных групп больных с воспалительными заболеваниями пародонта.
Этиологическая диагностика данных микроорганизмов нередко крайне затруднительна из-за длительности и сложности проведения исследования наиболее широко известным методом анаэробного культивирования. В современных условиях микробиологической диагностики инфекционных заболеваний стало возможным использование молекулярно-генетических технологий, таких как полимеразная цепная реакция (ПЦР). Быстрота, высокая чувствительность, которые позволяют выявить единичные молекулы специфической ДНК в течении нескольких часов, а также не обязательность присутствия живых микроорганизмов, что облегчает транспортировку материала в лабораторию – все это способствует более эффективному решению задач в клинической диагностике.
Детекция патогенов осуществлялась методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Материалом для исследования служили препараты ДНК, выделенные из образцов зубного налёта и отделяемого пародонтальных карманов больных с воспалительными заболеваниями пародонта. Забор материала для ПЦР осуществлялся стерильными разовыми зондами Accellon multi (Швеция) с синтетическим ворсом и стерильным стоматологическим экскаватором. Выделение ДНК проводилось щелочным методом с помощью наборов «ДНК-экспресс» (НПФ «ЛИТЕХ», Москва). В качестве ДНК-мишени использовались нуклеотидные последовательности генов 16S rRNK Actinobacillus actinomycetemcomitans и Porphyromonas gingivalis (Tran, Rudney 1996). ПЦР-тест-система составлена нами из следующих ингредиентов: праймеры AaF, PgF, C11R - 12 пмоль/мкл каждого; фермент Taq-pol - 5 ед/мкл; дезоксинуклеотидтрифосфаты (дНТФ)- 2 мМ; реакционный буфер 10х (трис-НCl - 0,7 М, сульфат аммония - 0,2 М, Твин 20 - 0,1 %, рН 8,5); раствор хлорида магния (MgCl2) - 10 мг/мл; раствор БСА - 4 мг/мл; вода деионизованная стерильная; вазелиновое масло. Все праймеры синтезированы фосфоамитидным методом с использованием олигосинтезатора Cene Assembler Plus (Pharmacia Biotech, Швеция). Использованы реактивы фирмы «Sigma» (США), а также наборы для ПЦР («Клинбиотех», или VDI “Fermentas”, Литва).
Праймеры AaF, PgF вносят в реакционную смесь в количестве 1 мкл каждого, C11R – 2 мкл, дНТФ - 2,5 мкл, 10хПЦР буфер - 2,5 мкл, MgCl2 - 1,0 мкл, БСА - 1,0 мкл, фермент - 0,25 мкл, пробу - 10 мкл, деионизованную воду до конечного объема - 25 мкл. Амплификацию осуществляли под контролем компьютерной программы МС16 на мультициклере «Терцик» МС-2 (АО «ДНК-технологии»). Температурный режим реакции: предварительная денатурация ДНК при температуре 94 0С в течение 5 мин; 35 циклов, включающих в себя денатурацию ДНК при температуре 95 0С в течение 1 мин., отжиг праймеров при температуре 61 0С в течение 1 мин., синтез коплементарной цепи при температуре 72 0 С в течение 2 мин. После последнего цикла пробирки прогревают в течение 5 мин при температуре 72 0С. Учёт результатов ПЦР проводилась гель-элекрофорезом в 1,5% агарозе (Sigma, Type I, США) в трис-боратной буферной системе с цифровой видеодокументацией.. Для определения размеров ампликонов использовали маркеры молекулярного веса ДНК 100 и 1000 пар нуклеотидов (п. н.) с размерами фрагментов: 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100 и 10000, 8000, 6000, 5000, 4000, 3000 x 2, 2500, 2000, 1500, 1000 x 2, 750, 500, 250 п. н. соответственно («Медиген», Новосибирск). Результаты электрофореза документировали с помощью видеосистемы «DNA Analyzer» с программой «Gel Imager 3.0». Определение молекулярного веса ампликонов производили с использованием программы «Gel Analysis 1.0».
Нами проведено клиническое обследование больных с воспалительными заболеваниями пародонта. Кроме основных методов обследования (опрос, осмотр, пальпация, перкуссия, определение глубины пародонтальных карманов и др.), использовалась индексная оценка состояния тканей пародонта и рентгенологическое обследование. Для определения состояния тканей пародонта применялся индекс гигиены (ГИ) Федорова-Володкиной в модификации, проба Шиллера-Писарева, папиллярно-маргинально-альвеолярный индекс (PMA) пародонтальный индекс (ПИ) Рассела, степень кровоточивости и степень подвижности. Из рентгенологических методов обследования использовались ортопантомограмма и радиовизиография.
В ходе нашего исследования было обследовано 55 пациентов с воспалительными заболеваниями пародонта. Все обследуемые были разделены на 3 возрастные группы: первая группа включала 10 больных от 13 до 25 лет, вторая группа – 22 пациента от 26 до 45 лет, третья группа – 23 человека 46 лет и старше. В ПЦР выявлено 8 положительных результатов детекции A. actinomycetemcomitans и 18 - на наличие инфекции P. gingivalis, что составляет 14,5% и 33,7% соответственно. У 8 пациентов одновременно обнаруживались оба патогенна (14,5%). В первой возрастной группе данные патогены обнаруживались редко – всего 2 положительных пробы 1 на A. actinomycetemcomitans, другая выявила A. actinomycetemcomitans и P. gingivalis одновременно. Во второй группе наиболее часто выявлялся P. gingivalis – 9 положительных групп, 3 пробы были положительны на A. actinomycetemcomitans и в 2 пробах обнаружили оба патогенна. Третья группа характеризовалась высокой распостранненостью как A. actinomycetemcomitans (4 положительных пробы) , так и P. Gingivalis (9 положительных проб) в 5 образцах выявлена комбинация P. Gingivalis и A. Actinomycetemcomitans. Для пациентов с положительной пробой на Actinobacillus actinomycetemcomitans характерна клиническая картина хронического генерализованного пародонтита средней и тяжелой степени тяжести (пародонтальные карманы глубиной от 4 до 6 более мм. II и III степень кровоточивости, I и II степень подвижности зубов ГИ = 3 и более). Porphyromonas gingivalis определялся у пациентов с язвенно-некротическим гингивитом и хроническим генерализованым пародонтитом в стадии обострения. Воспалительные заболевания с микстовой детекцией Actinobacillus actinomycetemcomitans и Porphyromonas gingivalis отличались наиболее агрессивным течением, деструкция костной ткани была выражена в значительной степени, степень подвижности зубов II и III. На основании этих данных можно сделать вывод, наличие инфекции Actinobacillus actinomycetemcomitans или Porphyromonas gingivalis способствует развитию хронических форм пародонтита. Ассоциации двух данных микроорганизмов приводят к быстрому и в значительной степени деструктивному течению хронического генерализованного пародонтита.
Полученные данные показывают увеличение распространенности A. Actinomycetemcomitans и P. gingivalis с возрастом человека, что возможно связано с изменениями защитных систем организма и пародонта в частности. Учет указанных особенностей позволяет более точно и своевременно диагностировать поражения пародонта, а главное, проводить профилактику и квалифицированное лечение его заболеваний.
|
| Категорія: Актуальні проблеми інфекційної патології | Додав: koljan
|
| Переглядів: 490 | Завантажень: 0
|
Додавати коментарі можуть лише зареєстровані користувачі. [ Реєстрація | Вхід ] |
|
|
