Статистика
Онлайн всього: 10 Гостей: 10 Користувачів: 0
|
 |
Матеріали для курсової |
Высокочувствительная ПЦР-диагностика инфекций, передаваемых клещами: возможности и ограничения применения метода, предложения по стандартиза
|
| 08.11.2014, 11:30 |
| Клещи являются переносчиками широкого спектра микроорганизмов, вызывающих инфекционные заболевания как у человека, так и у животных. Из них на территории России наиболее широко распространены клещевой энцефалит, вызываемый вирусом клещевого энцефалита (ВКЭ), и иксодовый клещевой боррелиоз (ИКБ или болезнь Лайма), вызываемый спирохетами комплекса Bоrrelia burgdorferi sensu lato. В настоящее время, основными методами диагностики клещевых инфекций являются иммуноферментный анализ (ИФА), иммуноблот и полимеразная цепная реакция (ПЦР). Однако принципы клинической диагностики этих инфекций до сих пор во многом не формализованы. Выявление маркеров клещевых инфекций, предполагает обнаружение инфекционного агента не только у пациента, но и, если имеется такая возможность, у клеща. Выявление того или иного патогена в клеще не обязательно указывает на инфицирование укушенного, и, тем более, на развитие заболевания, но является основанием для превентивной терапии. А наличие в анамнезе больного факта присасывания инфицированным клещом в дальнейшем может способствовать постановке правильного диагноза заболевания и его лечения.
Данные о вирусофорности клещей в разные годы и в разных районах, а также о распределении наблюдаемых в них бактериальных и вирусных нагрузок, существенно различаются. Не в последнюю очередь это связано с использованием для их выявления методик, имеющих принципиально разную аналитическую и диагностическую чувствительность. К факторам, ответственным за риск развития заболевания после укуса человека клещем, относят, как минимум, иммунный статус пациента, вид, штамм патогена и его дозу, полученную пациентом. Учитывая разнообразие этих факторов, затруднительно определить клинически значимые нагрузки возбудителей клещевых инфекций. В этой связи, для выявления таких патогенов актуально использование диагностических наборов с максимальной чувствительностью.
В последнее десятилетие для диагностики клещевых инфекций все шире применяется полимеразная цепная реакция (ПЦР). К ее достоинствам, в особенности проявляющимся при использовании ПЦР с детекцией в режиме реального времени (Real-time PCR), относится высочайшая чувствительность и специфичность, а также возможность определения количества патогена в исследуемом материале посредством вычисления количества копий нуклеиновых кислот (НК) в анализируемом образце. Требование сочетания максимальной чувствительности и высокой надежности выявления инфекционных агентов в клещах при помощи ПЦР предполагает необходимость надежного контроля качества экстракции НК из клеща. Процедуры выделения НК из клещей включают: предварительную отмывку клещей от загрязняющих веществ, их измельчение после заморозки, лизис биоматериала, многоступенчатую очистку НК от примесей. Иногда клещи претерпевают длительное хранение перед осуществлением анализа. При этом не исключены потери материала за счет деградации НК, неэффективной методики ее экстракции и детекции, различного рода ошибок лаборанта и т.п. Необходимость стандартизации методик выделения НК из клещей обсуждается в литературе, но такая стандартизация до сих пор не применяется в клинической диагностике.
Целями данной работы являлись:
разработка и апробация высокочувствительных диагностических ПЦР-тест-систем для выявления РНК ВКЭ, ДНК B.burgdorferi sensu lato в клещах, препаратах крови пациентов и других клинических образцах, полученных от больных;
Оценка возможностей диагностического набора для выявления ДНК Borrelia burgdorferi sensu lato при использовании его в комбинации с новым набором для экстракции НК при анализе препаратов крови и мочи;
исследование потенциала использования участков генома клеща Ixodes persulcatus в качестве мишеней для амплификации для обеспечения дополнительного контроля качества экстракции НК в сравнении с “классическими” экзогенными внутренними контролями (ВКО) - в виде “защищенной” рекомбинантной РНК (в составе бактериофага) или ДНК (в составе плазмиды).
Одной из основных задач разработки являлось обеспечение стабильности хранения компонентов диагностических ПЦР-наборов, для чего реакционные смеси были разработаны в лиофильно высушенном виде (готовая реакционная смесь в пробирке, включающая все необходимые компоненты для проведения реакции, кроме ДНК/РНК). Для оценки качества проводимого ПЦР-анализа (контроль потерь и деградации нуклеиновой кислоты) и контроля наличия ингибиторов ПЦР в подготовленном образце в состав наборов включен неконкурентный ВКО. Благодаря универсальной методике экстракции РНК/ДНК и совместимости протоколов реакций амплификации возможно одновременное проведение анализа на РНК ВКЭ и ДНК B.burgdorferi s.l.. Наборы для выявления РНК-содержащих вирусов – ВКЭ, вируса Западного Нила и др. разработаны в формате “одна пробирка на две реакции”, т.е. обратная транскрипция и ПЦР проводится в одной пробирке в ходе непрерывного протокола. Все это значительно облегчает и ускоряет проведение анализа.
На важность применения ПЦР в диагностике ИКБ указывает ряд фактов: специфические антитела к антигенам боррелии, как правило, обнаруживаются не ранее 2-3 недели от начала заболевания; в первый месяц от начала заболевания верификация ИКБ серологическими методами не превышает 50%, а общий процент подтверждения диагноза с помощью ИФА в настоящее время не превышает 75%.
Апробация набора реагентов «РеалБест ДНК Borrelia burgdorferi s.l.». Набор предназначен для выявления геномной ДНК патогенных для человека видов боррелий комплекса Borrelia burgdorferi sensu lato методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов амплификации в режиме реального времени. С помощью набора проведен анализ 12 референс-штаммов боррелий (Borrelia afzelii, Borrelia garinii, Borrelia burgdorferi s.s.), относящихся к компелксу Borrelia burgdorferi sensu lato. Генетическое разнообразие представленных штаммов боррелий подтверждено секвенированием. Выделение ДНК боррелии выполнено с помощью набора “РеалБест ДНК-экстракция 100” (ЗАО “Вектор- Бест”, г. Новосибирск). Проведенные исследования показали, что набор «РеалБест ДНК Borrelia burgdorferi s. l.» с равной эффективностью выявляет ДНК боррелии всех 12 референс-штаммов, что свидетельствует о способности обнаружения с помощью набора всех трех патогенных для человека видов боррелий, встречающихся на территории России.
По опубликованным данным в крови, спиннно-мозговой жидкости и моче больных ИКБ концентрация боррелий не превышает 50 клеток/мл. Большинство коммерческих наборов для экстракции нуклеиновых кислот созданы для работы с малым объемом клинического материала, а именно 100 мкл. Выделение единичных копий НК боррелии из такого объема будет затруднено в силу частичных потерь нуклеиновых кислот при экстракции. На основании приведенных выше фактов можно заключить, что ПЦР-тест-системы не смогут выявить НК боррелии в большинстве случаев в указанном клиническом материале.
Для повышения возможности выявления нуклеиновых кислот патогенов человека в сыворотке, плазме крови или моче больных мы предлагаем проводить процедуру выделения НК из большего объема (1 мл вместо стандартного объема 100 мкл) образца с помощью специализированного набора «РеалБест ДНК-экстракция 1000», разработанного в ЗАО «Вектор-Бест». Увеличение анализируемого объема в 10 раз существенно повышает шанс выделения НК искомого объекта в исследуемом образце.
На модельных образцах сыворотки крови и мочи, содержащих боррелий (полученных in vitro) в количестве 50 клеток/мл, показано, что ДНК B.burgdorferi s.l. успешно выделяется с помощью набора «РеалБест ДНК-экстракция 1000» и детектируется в реакции амплификации. Исходя из реально низких нагрузок боррелии, ВКЭ и др. патогенов человека в большинстве клинических проб, новую методику, позволяющую выделять необходимое число копий НК для проведения ПЦР-анализа, можно рекомендовать к применению в клинической диагностике.
С помощью разработанных нами ПЦР тест-систем было исследованы 32 образца мочи от больных, поступивших в стационары города Томска с диагнозом КЭ и ИКБ на наличие ДНК B. burgdorferi s.l. Замороженные образцы мочи объемом 7-10 мл после оттаивания центрифугировали при 3500 об./мин в течение 10 минут. Выделение ДНК проводили с помощью набора «РеалБест ДНК-экстракция 1000» из осадков и надоасдочного слоя мочи объемом 1 мл. ДНК B. burgdorferi s. l. была выявлена методом Real-Time ПЦР в шести образцах. Значения пороговых циклов (Ct) составили 37-40, что свидетельствовало о малой концентрации выделенной ДНК боррелии (менее 20 копий на пробу). Согласно представленных в анамнезе данных, среди этих шести больных, у пяти отмечен факт присасывания клеща, один больной имел диагноз ИКБ на основания наличия антител класса IgM к боррелиям, второй микст-инфекцию (наличие эритемы, IgM к B.burgdorferi, IgG к ВКЭ). Еще у троих больных не выявлено ни антител IgM, ни IgG к боррелиям, но у одного из них отмечен факт перенесения заболевания ИКБ в 2006 году. У последнего больного отсутствовали какие-либо данные в анамнезе. Представленные данные подтверждают значимость метода ПЦР для правильной постановки диагноза.
По мнению специалистов, основной акцент при проведении ПЦР-анализа следует сделать на выявлении ДНК боррелии в клещах, укусивших людей, поскольку своевременное обнаружение инфекции и проведение экстренной антибиотикопрофилактики позволят предотвратить развитие заболевания ИКБ. Набор «РеалБест ДНК Borrelia burgdorferi s.l.» прошел предварительные испытания на 187 клещах Ixodes persulcatus, собранных в окрестностях г. Новосибирска. С помощью данного набора установлено, что 56% исследованных клещей инфицировано боррелиями комплекса Borrelia burgdorferi s. l.. Для контроля часть выборки (76 клещей) исследовали с помощью набора сравнения «АмплиСенс® Borrelia burgdorferi sensu lato-FL» производства ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора. Результаты выявления ДНК боррелии в клещах с помощью двух систем совпали на 93,4 %. Расхождение с результатами, полученными с помощью набора «РеалБест ДНК Borrelia burgdorferi s.l.» наблюдалось для образцов с очень малой концентрацией ДНК боррелии (Ct > 37). Набор сравнения не выявил 4 слабоположительные пробы.
Набор «РеалБест РНК ВКЭ» для обнаружения РНК ВКЭ методом ПЦР в режиме реального времени прошел апробацию как на полевом, так и на клиническом материале. Так, в течение весны-начала лета 2009 г. методом ПЦР нами были проанализированы на наличие ВКЭ более 800 клещей, собранных в Новосибирской области. Исследованию подвергались как индивидуальные особи, так и пулированные образцы. Обнаружено, что 7,2-9,4% клещей инфицированы ВКЭ, в зависимости от размера выборки и места сбора. Полученные статистические данные согласуются с опубликованными результатами других исследователей. Среди клещей положительных по РНК ВКЭ часто встречаются особи со слабой вирусной нагрузкой (менее 103 копий РНК на реакцию ПЦР в режиме реального времени) - 61,5% положительных образцов. Очевидно, что при наличии слабоположительных проб пулирование приводит к искажению статистики. Так среди 90 проанализированных пулов (по 3 клеща), выявлено 6 пулов (6,7% от общего количества образцов), положительных по РНК ВКЭ и лишь один из них оказался слабоположительным.
Проведена работа по определению корреляции выявляемости возбудителя клещевого энцефалита в суспензиях клещей методами Real-Time ПЦР и ИФА с помощью наборов «РеалБест РНК ВКЭ» и «ВектоВКЭ-антиген-стрип». Показана хорошая корреляция выявляемости РНК и антигена ВКЭ для сильноположительных (по данным ПЦР) образцов. Так, в анализируемых образцах методом Real-Time ПЦР определены пороговые циклы в диапазоне - 16-24, а титры антигена по результатам ИФА составили 1:160-1:640. При этом слабоположительные (по данным ПЦР) пробы показали отрицательные результаты в иммуноферментном анализе, что говорит о более высокой чувствительности разработанной ПЦР-тест-системы.
Методами ПЦР в режиме реального времени и ИФА проведен скрининг 210 клинических образцов (сыворотка и плазма крови) с подозрением на наличие клещевых инфекций (ИКБ или КЭ), полученных из лечебных учреждений г. Новосибирска и г. Томска. В работе использованы наборы «РеалБест РНК ВКЭ», «ВектоВКЭ-IgM-стрип» и «ВектоВКЭ-IgG», производства ЗАО «Вектор-Бест». РНК ВКЭ обнаружена только у 2 больных, при том нагрузка по РНК была низкая. Стоит подчеркнуть, что положительный результат в обоих случаях получен в образцах, взятых на анализ при первичном обращении пациентов, т.е. в начале заболевания. Методом ИФА подтверждено наличие антител IgM к ВКЭ только в одном из данных образцов. При вторичном заборе крови (через 7-10 дней после первого) у этих больных РНК ВКЭ не была выявлена, тогда как антитела IgM и IgG к ВКЭ были обнаружены в обоих случаях. В результате тестирования всей выборки образцов методом ИФА показано, что 20,5% образцов содержат антитела класса IgM к ВКЭ (всего 3,8% - только IgM), 51% образцов содержат антитела класса IgG к ВКЭ (34,3% - только IgG), 45,2% образцов являются отрицательными по данным маркерам КЭ. Из полученных данных видно, что РНК ВКЭ присутствует в сыворотке (плазме) крови в малом количестве и непродолжительное время с момента инфицирования. Таким образом, метод Real-Time ПЦР может быть рекомендован только как дополнительный при проведении первичного исследования сыворотки или плазмы крови пациента на маркеры ВКЭ.
Для повышения контроля качества выполняемого ПЦР-анализа созданы тесты для количественного определения фрагментов генома клеща I. persulcatus. Проведена оценка влияния вариаций методики экстракции НК и условий хранения пробы на количество детектируемой мтДНК I. persulcatus и выявляемость B. burgdorferi sensu lato и ВКЭ, а также влияния ингибиторов на результат анализа. Генетическая консервативность выбранного участка ДНК подтверждена секвенированием. Показано, что амплификация фрагментов геномной ДНК клеща в качестве эндогенного контроля позволяет более эффективно оценивать качество выполняемого ПЦР-анализа и отслеживать погрешности в его исполнении, чем “классический” подход с применением экзогенного ВКО. Полученные данные указывают, что без применения эндогенного контроля недостаточная квалификация исполнителя или неоптимальный протокол анализа могут приводить к существенному числу ложноотрицательных результатов.
|
| Категорія: Актуальні проблеми інфекційної патології | Додав: koljan
|
| Переглядів: 606 | Завантажень: 0
|
Додавати коментарі можуть лише зареєстровані користувачі. [ Реєстрація | Вхід ] |
|
|
