Статистика
Онлайн всього: 6 Гостей: 6 Користувачів: 0
|
 |
Матеріали для курсової |
ОТРИМАННЯ МОНОКЛОНАЛЬНИХ АНТИТІЛ
|
| 27.09.2014, 21:04 |
| Ефективність препаратів антитіл, отриманих при імунізації тварин, змінюється від однієї партії до
іншої, оскільки в одних випадках під час проведення імунізації антитілопродукувальні клітини
сильніше стимулюються одними детермінантами певного антигену, а в інших імунна система
активніше відповідає на інші епітопи того самого антигену. Це може впливати на здатність різних
препаратів антитіл сполучатися з антигенами, оскільки окремі епітопи мають різну ефективність
(стимулювальну здатність). Тому в одній партії поліклональних антитіл може міститися мало
молекул, спрямованих проти основного епітопа, і в результаті вона буде менш ефективною, ніж
інша. Щоб підвищити специфічність антитіл, для діагностики часто використовують моноклональні
антитіла. В-лімфоцити (В-клітини), що синтезують антитіла, не можуть тривалий час
культивуватися в культурі in vitro. Вирішення цієї проблеми дослідники бачили у створенні
гібридної клітини. Отримавши генетичну складову від В-клітини, вона могла б виробляти антитіла,
а отримавши здатність до поділу від клітин сумісного типу, — рости в культурі. Було відомо, що В-
лімфоцити іноді перероджуються і стають раковими (мієломними) клітинами, набуваючи здатності
до росту в культурі і зберігаючи разом з тим багато властивостей В-клітин. Так клітини мієломи,
насамперед ті, що не виробляють антитіл, стали кандидатами на злиття з антитілопродукувальними
В-клітинами.
Перший крок у процесі отримання гібридної клітинної лінії, що продукує антитіла однієї
специфічності, полягає у введенні мишам антигену – імунізації. Після циклу імунізації, проведеного
впродовж кількох тижнів, перевіряють, чи відбувся розвиток у тварин імунної відповіді. Якщо
відповідь розвинулася, то у тварин беруть селезінку, промивають її, подрібнюють і злегка
струшують для вивільнення одиничних клітин, серед яких знаходяться й антитілопродукувальні В-
клітини. Клітини селезінки змішують із суспензією спеціальних мієломних клітин, дефектних
(мутантних) за ферментом гіпоксантин-гуанін-фосфорибозилтрансферазою (ГГФРТ). Таку
суспензію впродовж кількох хвилин інкубують у 35 %-му розчині поліетиленгліколю, а потім
переносять у середовище, що містить гіпоксантин, аміноптерин і тимідин (середовище ГАТ).
Оброблення поліетиленгліколем сприяє злиттю клітин, проте воно відбувається рідко і є
здебільшого випадковою подією. У суміші містяться клітини мієломи, селезінки, а також гібридні
(ті, що злилися) клітини мієломи-селезінки. Однак у середовищі ГАТ ростуть тільки гібридні
клітини мієломи-селезінки, всі інші типи клітин гинуть. Клітини селезінки, що злилися, взагалі не
ростуть у культурі in vitro, а дефектні (мутантні) мієломні клітини ГГФРТ не можуть
використовувати гіпоксантин як попередник у процесі біосинтезу пуринових основ гуаніну й
аденіну, без яких неможливий синтез нуклеїнових кислот. Однак у них є інший природний шлях
синтезу пуринів — за участю дигідрофолатредуктази, тому до складу середовища і входить
аміноптерин, що інгібує активність цього ферменту. Отже, мієломні клітини ГГФРТ не можуть
синтезувати пурини в середовищі ГАТ і гинуть.
Клітини селезінки-мієломи, що злилися, ростуть у середовищі ГАТ, оскільки клітини селезінки
постачають функціональний фермент ГГФРТ, що надає гібридомі здатності утилізувати екзогенний
гіпоксантин середовища, незважаючи на блокування синтезу пуринів за участю
дигідрофолатредуктази аміноптерином, та за рахунок здатності клітин мієломи до активного поділу.
Тимідин потрібен для усунення блокування в синтезі піримідинів, зумовленого інгібуванням
дигідрофолатредуктази. На 10 —14-ту добу після злиття клітин у середовищі ГАТ залишаються і
ростуть тільки злиті гібридоми селезінки-мієломи. Їх потім вносять у заглиблення пластикових
мікротитрувальних планшетів і вирощують на повному культуральному середовищі без ГАТ.
Після проведення злиття й отримання гібридоми потрібно здійснити ідентифікацію (скринінг)
гібридних клітинних ліній, що секретують специфічні антитіла до антигену, який використали для
імунізації. Для цього зазвичай проводять скринінг культуральних середовищ, що містять антитіла,
які секретуються, наприклад, імуноферментним аналізом. Щоб отримати лінії, які походять від
однієї клітини (клони), клітинну суспензію з таких заглиблень розбавляють культуральним
середовищем і висівають в інші заглиблення. Після культивування отриманих клонів середовища
знову тестують, визначаючи, яка з клітинних ліній (гібридом) продукує моноклональні антитіла
(МкАТ), що розпізнають антиген-мішень. У тому разі, коли отримують більш як одну специфічну
гібридому, проводять подальші дослідження, що дають змогу визначити, чи спрямовані антитіла,
які виробляються різними клонами, проти однієї й тієї самої антигенної детермінанти. Кожний клон,
що продукує моноклональні антитіла, можна підтримувати в культурі практично нескінченно. Крім
того, зразки можна заморозити в рідкому азоті й використовувати їх надалі як джерело клітин.
Іноді використовують культивування гібридом в організмі мишей. Для цього гібридому вводять у
черевну порожнину мишей сумісної генетичної лінії після попереднього пригнічення їхньої імунної
системи, наприклад, введенням мінерального масла. Гібридома (власне злоякісна пухлина)
приживається у черевній порожнині миші, починає розмножуватися і синтезувати значну кількість
антитіл, які можна виділити із асцитної рідини.
|
| Категорія: Імунологія | Додав: koljan
|
| Переглядів: 908 | Завантажень: 0
|
Додавати коментарі можуть лише зареєстровані користувачі. [ Реєстрація | Вхід ] |
|
|
