Статистика
Онлайн всього: 5 Гостей: 5 Користувачів: 0
|
 |
Матеріали для курсової |
Апоптогенная активность лимфоцитов периферической крови при инфекционном мононуклеозе
|
| 08.11.2014, 13:28 |
| Инфекционный мононуклеоз (ИМ) – острое, доброкачественное лимфопролиферативное заболевание, чаще всего встречающееся в детском или юношеском возрасте. Основным, но не единственным, этиологическим фактором инфекционного мононуклеоза является вирус герпеса 4-го типа – вирус Эпштейна-Барр (ВЭБ) [3]. ВЭБ обладает тропностью к эпителиальным клеткам носоглотки и В-лимфоцитам. После внедрения вируса В-клетки трансформируются в ВЭБ-презентирующие клетки и приобретают способность к неограниченной пролиферации [8]. При этом центральная роль в элиминации вируса и инфицированных клеток отводится Т-клеточному ответу, в том числе цитотоксическим и естественным клеткам-киллерам, основными формами цитотоксичности которых являются секреция цитокинов, индукция апоптоза инфицированных клеток и опосредованный антителами киллинг [5].
Апоптоз представляет особый интерес. Он опосредует патогенез многих инфекционных заболеваний, так как их возбудители оказывают разнообразное влияние на программированную гибель клеток – стимулирующее или подавляющее. Попадая в организм, ВЭБ ингибирует программу апоптоза поражаемых им клеток, что опосредует его длительную (нередко пожизненную) внутриклеточную персистенцию. Наряду с этим, апоптотическая гибель клетки-мишени, презентирующей на своей поверхности вирусные антигены, индуцируется клетками иммунной системы. Известно, что цитотоксические CD8+ Т-лимфоциты (ЦТЛ) и естественные киллеры способны распознавать и направленно уничтожать клетки, зараженные вирусом, не провоцируя значительного воспаления. Реализация цитотоксической (апоптогенной) активности ЦТЛ и NK-клеток осуществляется путем экзоцитоза цитолитических факторов – перфорина и гранзимов [2]. Посредством перфорина в мембране клетки-мишени образуются поры, через которые поступают гранзимы (сериновые протеазы и TNFβ), напрямую активирующие каспазы-8, -3 и запускающие таким образом каскад внутриклеточных разрушений. В то же время появляются данные, что, к примеру, сами ЦТЛ являются нечувствительными к воздействию гранзимов, синтезируя специфические эндогенные ингибиторы сериновых протеаз [4]. Кроме того, реализация цитотоксичности Т-лимфоцитов (но не NK-клеток) может быть связана с индукцией рецепторзависимого апоптоза, механизмы развития которого обусловлены лиганд-рецепторными взаимодействиями между Fas-рецептором, экспрессируемым клеткой-мишенью, и Fas-лигандом Т-киллера [1]. Рецепторопосредованный и перфорин-гранзимовый механизмы могут вызывать апоптоз клеток-мишеней совместно или независимо друг от друга. Предполагается, что это главный способ Т-киллинга при вирусной инфекции [9]. В связи с этим, целью настоящего исследования явилась оценка цитотоксической (апоптогенной) активности лимфоцитов крови у детей с ИМ в период клинико-гематологической манифестации болезни и в фазу ранней реконвалесценции.
Материалы и методы. Обследовано 20 детей (12 мальчиков и 8 девочек) в возрасте от 3 до 6 лет, больных ИМ, вызванным ВЭБ, средней степени тяжести. Больные были обследованы в фазу разгара заболевания (4-15-й день болезни) и в фазу ранней реконвалесценции (спустя 26-30 дней от начала заболевания). Диагноз ИМ устанавливался по наличию типичных клинических симптомов, изменений в общем анализе крови (повышение количества мононуклеарных лейкоцитов крови, появление атипичных мононуклеаров (АМ)) и положительных результатов иммуноферментного анализа (ИФА) сыворотки крови (определяли IgМ к капсидному антигену (VCA-IgM), IgG к раннему антигену (EA IgG) и IgG к ядерному антигену (NA-IgG) ВЭБ с использованием стандартных тест-систем производства ЗАО «Вектор-Бест», Новосибирск).
Группу сравнения составили 10 здоровых доноров с сопоставимыми характеристиками по полу и возрасту. Исследования проводились в соответствии с этическими нормами. Материалом исследования являлась периферическая кровь. Выделение лимфоцитов из цельной крови производили на градиенте плотности фиколл-урографина (1,077 г/см3). Для исследования субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови на клетках определяли поверхностные CD-рецепторы (CD8, CD16); для оценки апоптоза лимфоцитов периферической крови исследовали количество CD95-, CD95L- и annexin V-положительных клеток (иммунофлуоресцентный метод). Результаты выражали в относительных (%) и абсолютных (×109/л) значениях.
Статистический анализ полученных данных осуществляли с помощью программы Statistica for Windows Version 6.0 (StatSoft Inc., США). Для проверки выборочных данных на нормальность распределения использовали критерий Колмогорова-Смирнова. В виду отсутствия согласия данных с нормальным распределением для оценки различий между зависимыми и независимыми выборками применяли непараметрические критерии Вилкоксона и U Манна-Уитни соответственно. Различия считали достоверными при р-уровне < 0,05.
Результаты. При исследовании субпопуляционного состава лимфоцитов у детей, больных ИМ, отмечалось достоверное повышение (сравнительно с нормой) абсолютного содержания CD8+-, CD16+-клеток в крови в острый период заболевания (в 2,5 раза, р<0,01 и р<0,05 соответственно) и в период ранней реконвалесценции (р<0,05). Кроме того, в острый период заболевания в периферической крови отмечалось увеличение относительного содержания CD8+-, CD16+- лимфоцитов (в среднем в 1,5 раза, р<0,05) по сравнению с показателями у здоровых детей аналогичного возраста.
Также в острый период заболевания у детей, больных ИМ, было установлено повышение относительного и абсолютного содержания CD95+ и CD95L-презентирующих лимфоцитов в крови (р<0,01). В период выздоровления относительное содержание предуготовленных к апоптозу (CD95+) лимфоцитов нормализовалось, в то время как абсолютное их количество (равно как и относительное содержание CD95L+-лимфоцитов), несмотря на существенное его снижение по сравнению с предыдущим этапом исследования (р<0,05), по-прежнему превышало величину аналогичного показателя в группе сравнения. При этом абсолютное количество CD95L+-клеток в период выздоровления не претерпевало значимых изменений по сравнению с предшествующим периодом исследования. Наряду с этим, у больных ИМ в острый период заболевания и в период ранней реконвалесценции было повышенным количество annexin V-положительных лимфоцитов по сравнению с нормой (р<0,01).
Обсуждение. Увеличение численности Т-лимфоцитов с фенотипом CD8+ у детей, страдающих ИМ, служит свидетельством доброкачественного течения заболевания, поскольку CD8+-клетки являются специализированными «клетками-убийцами», ответственными за распознавание вирусопределяющих эпитопов на поверхности инфицированных В-лимфоцитов и апоптоз ВЭБ-трансформированных клеток. Тем самым они препятствуют малигнизации лимфопролиферативного процесса и обеспечивают иммунобиологический надзор за постоянством клеточного состава организма [7]. Увеличение содержания СD16+-лимфоцитов также связано с развитием ответной иммунной реакции организма-хозяина против ВЭБ, поскольку они способны секретировать (помимо индукции апоптоза и участия в реакциях антителозависимой цитотоксичности) интерферон γ – важный компонент противовирусной защиты. Кроме того, на основании полученных результатов мы можем заключить, что при ИМ реакция цитотоксического звена иммунитета у детей 3-6 лет является долговременной, что, вероятно, объясняется не только функциональной незрелостью их иммунной системы, но и повышенной чувствительностью интенсивно растущего организма к неблагоприятным воздействиям [6].
Одной из антиапоптотических стратегий вирусов, как известно, является блокирование пускового сигнала программированной клеточной гибели при взаимодействии апоптогенных рецепторов и соответствующих им лигандов. Показано также, что низкая экспрессия Fas-лиганда на поверхности мембраны определяет способность инфицированной клетки «ускользать» от киллерных воздействий со стороны активированных лимфоцитов, что, несомненно, является важным условием выживания внутриклеточных патогенов, в частности вирусов [10].
Вместе с тем, нами было отмечено повышение уровня экспрессии CD95 и CD95L на поверхности лимфоцитов в острый период ИМ и период выздоровления по сравнению с нормой. Установлено, что CD95L, связываясь с CD95 (специализированным рецептором Fas-зависимого пути танатогенной программы), включает цепь передачи сигнала, приводящего к апоптозу клеток, в том числе трансформированных вирусом, что следует рассматривать при ИМ как механизм саногенеза [9].
Уровень апоптоза в популяции лимфоцитов периферической крови в работе определяли путем установления экспрессии на наружном монослое плазматической мембраны молекул фосфатидилсерина методом флуоресцентной микроскопии с использованием FITC-меченного annexin V. Релокализация фосфатидилсерина из внутреннего монослоя на поверхность мембраны отмечается, начиная с ранней стадии апоптотической гибели вплоть до полной деградации клетки, и служит сигналом к фагоцитозу апоптотирующей клетки и ее фрагментов (апоптотических тел) соседними макрофагами. Аnnexin V поптотирующей клетки и ее фрагментов (апоптотических телец) , принадлежащий к семейству кальций-зависимых белков, с высокой степенью аффинности связывается с экспонированными на поверхности гибнущих клеток фосфолипидами и ингибирует их провоспалительную и прокоагулянтную активность [4].
При изучении показателей, характеризующих спонтанный уровень программированной гибели лимфоцитов у детей, больных ИМ, было зарегистрировано обогащение фракции лимфоцитов апоптотическими клетками, как в острый период заболевания, так и в фазу раннего выздоровления. Это можно рассматривать как защитную реакцию организма, направленную на ограничение дальнейшего распространения вируса вследствие гибели зараженных В-лимфотропным вирусом (ВЭБ) клеток. С другой стороны, чрезмерная гибель лимфоцитов, осуществляющих реализацию противовирусного иммунитета, может обуславливать дефект Т-звена и неадекватность иммунного ответа, что позволяет вирусу длительно сохраняться в организме с формированием хронического инфекционного процесса [8].
Выводы:
Клинико-гематологическая манифестация инфекционного мононуклеоза у детей 3-6 лет сопровождается увеличением содержания СD8+- и СD16+-лимфоцитов в периферической крови, сохраняющимся в фазу ранней реконвалесценции.
При инфекционном мононуклеозе у детей активируется Fas-зависимый апоптоз лимфоцитов, что подтверждается увеличением содержания апоптотических и СD95+, CD95L+ клеток в крови, наиболее выраженным в острый период болезни.
Повышение числа СD95L+ и annexin V+ лимфоцитов в периферической крови в острый период инфекционного мононуклеоза и фазу клинического выздоровления свидетельствует об активации апоптогенной функции СD8+ Т-клеток и натуральных киллеров.
|
| Категорія: Актуальні проблеми інфекційної патології | Додав: koljan
|
| Переглядів: 597 | Завантажень: 0
|
Додавати коментарі можуть лише зареєстровані користувачі. [ Реєстрація | Вхід ] |
|
|
