Статистика
Онлайн всього: 4 Гостей: 4 Користувачів: 0
|
 |
Матеріали для курсової |
Біосинтез інтерферонів у клітинах генетично модифікованих організмів
|
| 27.09.2014, 21:05 |
| Клонувати гени
інтерферону було значно складніше, ніж у перших успішних експериментах, проведених за
допомогою генної інженерії. Для перших рекомбінантних молекул (інсулін, гормон росту) була
відома послідовність амінокислот. Для інтерферону таких відомостей не було. Тому було зроблено
спроби пошуку можливих способів отримання інтерферону на основі його противірусної
активності.
У 1989 р. Гілберт і Вайсман з Бостона повідомили, що їм вдалося отримати інтерферон людини в
генетично модифікованих мікроорганізмах. Цей дослід ґрунтувався на спостереженні, що при
ін'єкції мРНК з інтерферонпродукувальних лімфоцитів у гігантські ооцити Xenopus в останніх
синтезується інтерферон. Було визначено розмір матричної РНК альфа-інтерферону. Для цього полі-
А-вмісну РНК з інтерферонпродукувальних клітин фракціонували, окремі фракції вводили в ооцити
і визначали противірусну активність білкових продуктів. Активність було зафіксовано при ін'єкції в
ооцити 12S РНК, і саме цю фракцію було використано для конструювання бібліотеки кДНК в
плазміді pBR322. Було перевірено близько 20 000 клонів Е. соlі, отриманих при трансформації
плазмідами бібліотеки. Послідовності було ідентифіковано гібридизацією індивідуальних клонів
кДНК з альфа-інтерфероновою мРНК шляхом соузерн-блотингу. Спочатку виділяли великі групи, з
яких потім відбирали менші підгрупи в межах цього клону. Для доведення того, що кДНК кодує
саме інтерферон, її вбудовували в бактерію і реєстрували противірусний ефект продукту. Одразу
після отримання рекомбінантного альфа-інтерферону тими самими методами було клоновано кДНК
бета- і гамма-інтерферонів.
Було показано, що гени альфа- і бета-інтерферонів близькі за нуклеотидним складом. Гени альфа-
інтерферону належать до великої генної родини, яка кодує різні субтипи альфа-інтерферону, а
також його неактивні форми. Для бета-інтерферону було клоновано лише один ген. Усі гени й
псевдогени альфа-інтерферону, а також єдиний ген бета-інтерферону локалізовані в 9-й хромосомі.
Деякі з них тісно зчеплені між собою. Жоден з генів альфа-інтерферону і ген бета-інтерферону не
містять інтронів. Бета- і деякі альфа-інтерферони глікозильовані.
У перших успішних генно-інженерних експериментах синтез був малоактивним. Підвищити
активність можна було завдяки використанню інших векторів або потужніших промоторів. Це
вдалося здійснити, використовуючи конструкції, що включали промотор лак-оперону.
Продукування підвищилося в десятки разів, що дало змогу отримувати 1 мг інтерферону з 1 л
культури. Одразу після вдалих експериментів з Е. соlі було використано еукаріотичні моделі —
дріжджі Saccharomyces. Саме на прикладі альфа-інтерферону було показано можливість експресії
генів людини в клітинах дріжджів. При трансформації Saccharomyces використали конструкцію,
здатну ефективно реплікуватися як у клітинах дріжджів, так і в бактеріальних клітинах — так звані
човникові вектори. В цьому досліді ген альфа-інтерферону об'єднували з геном
алкогольдегідрогенази дріжджів, що має потужний промотор. Для дріжджової системи характерний
дуже високий вихід. Крім того, глікозилювання та дозрівання молекул білків у дріжджів
відбувається за тими самими принципами, що й в інших еукаріотів, що особливо важливо для
отримання білків людини. |
| Категорія: Імунологія | Додав: koljan
|
| Переглядів: 705 | Завантажень: 0
|
Додавати коментарі можуть лише зареєстровані користувачі. [ Реєстрація | Вхід ] |
|
|
