Чутливість тест-системи – та мінімальна кількість речовини, яку можна визначити за допомогою даного способу в даних умо- вах. Звичайно визначають мінімальну концентрацію неміченого ліганда, при якій ще є відмінність в результатах аналізу мінімаль- ного і нульового стандарту (В 0 ). Ця відмінність повинна ґрунтува- тися на статистично вірогідних довірчих інтервалах, знайдених як 397 для В 0 , так і для стандарту. Наприклад, якщо при двох паралель- них визначеннях отримані величини 100 і 105, то середнє ариф- метичне значення дорівнює 102,5, а ймовірний інтервал станови- тиме 97,6-107,4. Якщо будуть проведені додаткові визначення, то ймовірний інтервал звузиться. Так, при показниках 99; 100; 105 і 106 середнє арифметичне не зміниться, однак ймовірний інтервал буде становити 99,1-105,9. Чутливість потрібно виражати концентрацією (маса на оди- ницю об’єму) речовини, що вимірюється в біологічній рідині, а не абсолютною кількістю речовини в пробі, як це нерідко ро- блять. Наприклад, істинна чутливість тесту становить 1 нг/мл; як- що об’єм інкубаційної суміші рівний 1 мл, то абсолютна кількість речовини, що аналізується, буде такою, що дорівнює 1 нг, але як- що об’єм інкубаційної суміші рівний 0,1 мл, то абсолютна кіль- кість буде становити всього 0,1 нг. На цій основі вирішують, що в останньому випадку чутливість вищае, тоді як насправді вона од- накова в обох випадках. Іноді чутливість помилково виражають у вигляді питомої величини відносно стандарту у водному розчині й отримують дуже низьку ефективну чутливість. Способи підвищення чутливості: 1) Зниження кількості міченого ліганда – ефективний спосіб підвищення чутливості тест-системи при умові обліку обмежень цього способу. Зокрема, при будь-яких заданих умовах (спорід- неність і концентрація зв’язуючого реагента, час інкубації) є така мінімальна концентрація міченого ліганда, при якій подальше її зниження не викликає змін чутливості аналізу. Тому підвищення питомої радіоактивності міченого ліганда з метою зниження його концентрації в реакційній суміші в багатьох випадках невиправ- дане, оскільки це збільшує ймовірність швидкого пошкоджен- ня ліганда, а чутливість при цьому не підвищується. При вибо- рі оптимальної кількості міченого ліганда потрібно вийти з того, щоб загальне число імпульсів на пробу складало не більше ніж 10000 у хвилину. Якщо мінімальна кількість міченого ліганда дає значно більше число імпульсів, необхідно знизити питому радіо- активність початкового препарату. 2) Зменшення кількості зв’язуючого реагента. У міру його зменшення чутливість аналізу буде підвищуватися. На практиці Методи радіоімунологічного аналізуВетеринарна радіологія 398 підвищення чутливості обмежене точністю тесту: чим вища чут- ливість, тим нижче відтворювання результатів. Емпірично доведе, що зниження кількості зв’язуючого реагента до такого мінімуму, при якому
В 0 —— .100% T не перевищує 20%, абсолютно неефективне, оскільки нівелюється зниженням точності. 3) Збільшення часу інкубації. Цей прийом можна використа- ти тільки при дуже низьких концентраціях (загальний час інку- бації може становити 7 діб). Недоліком є те, що у міру збільшен- ня часу інкубації підвищується можливість порушення нативної структури реагентів (зокрема, міченого ліганда) під дією інших компонентів системи (наприклад, білкові гормони можуть зазна- вати дії протеолітичних ферментів). Саме з цієї причини нерідко спостерігається зменшення з’єднання в нульовому стандарті (іно- ді радіоактивність виявляється навіть нижчою від першого стан- дарту), що несприятливо впливає на чутливість. 4) Скорочення тривалості інкубації. Якщо зупиняти реакцію раніше, ніж досягнута рівновага, то з’єднання в нульовому стан- дарті буде знижене, уявна ж чутливість може підвищитися. Такий ефект досягається шляхом передчасного розділення зв’язаного і вільного ліганда. У випадку великої партії проб можливі істот- ні відмінності між першою та останньою пробірками, оскільки в останній реакція може раніше наблизитися до стану рівноваги. 5) Зміна порядку додавання реагентів. При додаванні реаген- тів у послідовності “проба - мічений ліганд - зв’язуючий агент” мічений і немічений ліганд мають однакову можливість зв’язува- тися зі специфічними ділянками зв’язуючого реагента. При зміні порядку додавання міченого ліганда і зв’язуючого агента отриму- ють іншу калібрувальну криву і значно більш високу чутливість. Такий спосіб аналізу називається методом пізнього додавання мі- ченого ліганда. Можливість використання даного способу стосов- но тієї або іншої системи потрібно встановлювати емпірично. 6) Збільшення об’єму проби, що тестується. Об’єм проби, що тестується зазвичай не перевищує 10% загального об’єму інкуба- ційної суміші (наприклад, 50 мкл в 500 мкл). Оскільки інші реа- генти можна додавати без зниження точності в такому малень- кому об’ємі, як 50 мкл, то здається, що можна збільшити об’єм проби до 400 мкл і таким чином підвищити чутливість у 8 разів. Однак на практиці цей прийом використати не можна, оскільки збільшення об’єму проби приводить до наростання неспецифіч- ного ефекту. Останній незначний, якщо вміст проби в інкубацій- ній суміші не перевищує 10% загального об’єму. 7) Зміна температури інкубації. Швидкість досягнення біоло- гічними реакціями стану рівноваги в тестах in vitro зростає у 2 ра- зи при підвищенні навколишньої температури на 10°C. Однак пе- реважно підвищення температури не призводить до збільшення чутливості, але прискорює руйнування (наприклад, ферментатив- не) міченого ліганда. Верхньою межею температури вважають 45°С. При радіотестуванні in vitro частіше використовують пониження температури. Так, при застосуванні методу конкурентного білко- вого з’єднання константа спорідненості зв’язуючих білків помітно підвищується при зниженні температури, і, відповідно, збільшуєть- ся чутливість аналізу. Аналогічне явище спостерігається при раді- оімунологічному аналізі пептидів, тому для отримання виключно високої чутливості використовують низькі температури. Основним чинником, що визначає зниження чутливості тест-системи, є збільшення концентрації зв’язуючого реагента в інкубаційній суміші. При цьому калібрувальна крива зсувається праворуч, у бік вищих концентрацій неміченого ліганда. Цю об- ставину потрібно враховувати при розробці систем радіотесту- вання in vitro для визначення кількості речовин, присутніх у про- бі у високій концентрації (наприклад, β 2 -мікроглобулінів). У тест-системі з низькою чутливістю потрібно збільшувати кількість міченого ліганда. При цьому відпадає необхідність того, щоб ліганд мав високу питому радіоактивність і тим самим підви- щується стабільність. До інших переваг даного способу відноситься: 1) підвищення рівня з’єднання в нульовому стандарті, тобто збільшення крутості кривої і тим самим – точності вимірювання; 2) мінімальний час інкубації (після антитіла можна відразу додавати реагент); 3) об’єм проби, що тестується, може бути мінімальним (від- падає необхідність в її попередньому розбавленні); 4) зв’язуючий реагент, перебуваючи у відносному надлишку, може не володіти виключно високою спорідненістю до ліганда. Методи радіоімунологічного аналізу
Ви переглядаєте статтю (реферат): «Що представляє собою чутливість тест-системи» з дисципліни «Ветеринарна радіологія»
